Use este identificador para citar ou linkar para este item: http://hdl.handle.net/11612/1255
Autor(a): Teixeira, Tallyta Santos
Orientador: Siqueira, Félix Gonçalves de
Título: Estudo da atividade de mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) em substratos celulósicos por espectromeria de massas
Palavras-chave: LPMO de Thermobifida fusca (TfAA10); MALDI-TOF MS; UHPLC-ESI-MS; oligossacarídeos; hidrólise enzimática; Thermobifida fusca LPMO (TfAA10); MALDI-TOF MS; UHPLC-ESI-MS; oligosaccharides; enzymatic hydrolysis
Data do documento: 26-Fev-2018
Editor: Universidade Federal do Tocantins
Programa: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - PPGB
Citação: TEIXEIRA, Tallyta Santos. Estudo da atividade de mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) em substratos celulósicos por espectromeria de massas.2018.122f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Universidade Federal do Tocantins, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Gurupi, 2018.
Resumo: As mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são enzimas acessórias que auxiliam a ação de enzimas hidrolíticas na desconstrução da parede celular vegetal. O sinergismo dessas enzimas facilita a obtenção de monômeros de açúcares que são fundamentais para o metabolismo microbiano e para processos industriais. A caracterização das LPMOs é desafiadora, pois ela atua na celulose e em outros polissacarídeos através de clivagem oxidativa, resultando em diferentes tipos de oligômeros. Por isso, se faz necessário utilizar técnicas analíticas avançadas como a espectrometria de massas que permite a identificação de compostos químicos a partir da relação m/z (massa-carga). Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a ação da LPMO de Thermobifida fusca (TfAA10) recombinante em substratos celulósicos por espectrometria de massas. Duas construções gênicas foram avaliadas quanto à atividade de LPMO: 1) TfAA10-O (com códon otimizado) e 2) TfAA10-N (com códon nativo), sendo expressas em Khomagatella phaffi (Pichia pastoris). A TfAA10-O foi produzida em erlenmeyer (250 mL), enquanto que a TfAA10-N em erlenmeyer (250 mL) e biorreator (1 L). Os perfis destas enzimas foram analisados por MALDI-TOF MS, empregando ácido sinapílico e modo linear positivo, no qual observou duas isoformas, ou seja, duas proteínas que a partir da mesma sequência, possuem tamanhos moleculares diferentes (27 e 24 kDa). As atividades das LPMOs foram avaliadas em substratos celulósicos (Avicel PH101 e PASC), tendo o ácido ascórbico como doador de elétrons, e controles na presença e ausência de enzima e/ou ácido ascórbico. As condições reacionais e os métodos analíticos foram otimizados para permitir a análise dos produtos da reação enzimática. Dentre as condições reacionais avaliadas tem-se: tampões, concentrações de enzima e de ácido ascórbico, agitação, forma de purificação e substrato. O método analítico por MALDI-TOF MS foi otimizado quanto aos parâmetros instrumentais e ao método de preparo da amostra, já o método LCMS foi desenvolvido com base na literatura e otimizado com padrões de oligossacarídeos. Mesmo após a otimização dos métodos, em nenhuma das condições testadas foi possível detectar oligossacarídeos oxidados que confirmem a ação das LPMOs estudadas. Apesar disso, diversas informações foram relevantes para o estudo da ação dessas enzimas. Quanto as condições reacionais, os tampões de potássio se mostraram inviáveis para análises de hidrólise de LPMOs pela possibilidade de gerar falso-positivos, sendo indicados nestes casos os tampões de amônio ou sódio. Nas análises por MALDI-TOF MS, a adição de cloreto de sódio se mostrou adequada por permitir maior intensidade dos oligossacarídeos e também evitar a interpretação errônea de oligossacarídeos oxidados sodiados e não oxidados potassiados, que possuem mesmo valor m/z. O dopping de amostras contendo íons duvidosos com sais de lítio, potássio e/ou sódio podem auxiliar a revelar a identidade desses íons, permitindo verificar a presença de oligossacarídeos oxidados, em baixa concentração pela ação do ácido ascórbico, evidenciando assim a necessidade dos controles. A TfAA10-N produzida em biorreator apresentou oligossacarídeos nativos com menor grau de polimerização (DP2-DP4) ao longo dos tempos reacionais, nos tampões de acetato e de fosfato de sódio. Esse resultado foi observado em ensaios na presença da enzima (com e sem ácido ascórbico), quando analisada pelos dois métodos analíticos, sugerindo uma ação hidrolítica nas condições testadas. O método MALDI-TOF MS permitiu a análise de oligossacarídeos com maior grau de polimerização (DP3-DP9), enquanto o método UHPLC-ESI-MS mostrou adequado para oligossacarídeos menores (DP1-DP4) e também para análises de amostras mais complexas. Dessa forma, os métodos analíticos se mostraram ser complementares para a caracterização das LPMOs, podendo assim auxiliar no direcionamento das aplicações desta enzima. E este estudo mostrou que a TfAA10A expressa em K. phaffii não apresenta atividade em celulose (Avicel e PASC) provavelmente devido ao padrão de glicosilação que esta apresenta. Apenas oligossacarídeos nativos foram detectados, que podem estar relacionados à clivagem interna, mas que não são suficientes para comprovar a ação desta LPMO.
Abstract: The lytic polysaccharides monooxygenases (LPMOs) are accessory enzymes that help the action of hydrolytic enzymes in the deconstruction of the plant cell wall. The synergism of these enzymes facilitates the obtaining of sugar monomers that are fundamental for microbial metabolism and for industrial processes. The characterization of LPMOs is challenging, since it acts on cellulose and other polysaccharides through oxidative cleavage, resulting in different types of oligomers. Therefore, it is necessary to use advanced analytical techniques such as mass spectrometry that allows the identification of chemical compounds from the m/z ratio (mass-charge). Thus, this work had as objective to evaluate the action of the LPMO of Thermobifida fusca (TfAA10) recombinant in cellulosic substrates by mass spectrometry. Two gene constructs were evaluated for LPMO activity: 1) TfAA10-O (with optimized codon) and 2) TfAA10-N (with native codon), being expressed in Khomagatella phaffi (Pichia pastoris). TfAA10-O was produced in Erlenmeyer (250 mL), while the TfAA10-N in Erlenmeyer (250 mL) and bioreactor (1 L). The profiles of these enzymes were analyzed by MALDI-TOF MS, using synapylic acid and positive linear mode, in which two isoforms were observed, that is, two proteins that from the same sequence have different molecular sizes (27 and 24 kDa). The activities of the LPMOs were evaluated on cellulosic substrates (Avicel PH101 and PASC), having ascorbic acid as an electron donor, and controls in the presence and absence of enzyme and/or ascorbic acid. The reaction conditions and the analytical methods were optimized to allow the analysis of the products of the enzymatic reaction. Among the reaction conditions evaluated are: buffers, enzyme and ascorbic acid concentrations, agitation, purification form and substrate. The analytical method by MALDI-TOF MS was optimized for the instrumental parameters and the sample preparation method, since the LC-MS method was developed based on the literature and optimized with oligosaccharide standards. Even after the optimization of the methods, in none of the conditions tested was it possible to detect oxidized oligosaccharides that confirm the action of the LPMOs studied. Despite this, several pieces of information were relevant to the study of the action of these enzymes. Regarding the reaction conditions, potassium buffers were not feasible for hydrolysis analysis of LPMOs due to the possibility of generating false positives. In these cases, ammonium or sodium buffers were indicated. In the MALDI-TOF MS analyzes, the addition of sodium chloride was adequate to allow a greater intensity of the oligosaccharides and also to avoid the erroneous interpretation of potassium oxidized sodium and non-oxidized oligosaccharides, which have the same m / z value. Doping of samples containing lithium, potassium and / or sodium salts may help to reveal the identity of these ions, allowing the presence of oxidized oligosaccharides in low concentration by the action of ascorbic acid, thus evidencing the necessity of the controls. TfAA10-N produced in bioreactor showed native oligosaccharides with lower degree of polymerization (DP2-DP4) throughout the reaction times, in acetate and sodium phosphate buffers. This result was observed in the presence of the enzyme (with and without ascorbic acid), when analyzed by the two analytical methods, suggesting a hydrolytic action under the conditions tested. The MALDI-TOF MS method allowed the analysis of oligosaccharides with a higher degree of polymerization (DP3-DP9), while the UHPLC-ESI-MS method showed adequate for smaller oligosaccharides (DP1-DP4) and also for more complex sample analyzes. Thus, the analytical methods were shown to be complementary for the characterization of LPMOs, which may help to guide the applications of this enzyme. And this study showed that the TfAA10A expressed in K. phaffii shows no activity in cellulose (Avicel and PASC) probably due to the glycosylation pattern that it presents. Only native oligosaccharides were detected, which may be related to internal cleavage, but are not sufficient to prove the action of this LPMO.
URI: http://hdl.handle.net/11612/1255
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