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Author: Santos, Fernanda Pinheiro dos
Advisor: Brasil, Bruno dos Santos Alves Figueiredo
Title: Expressão e produção de monoxigenases bacterianas em komagataella phafii (pichia pastoris) para utilização como enzimas acessórias para desconstrução de biomassa
Keywords: Komagataella phafii;Thermobifida fusca;Monoxigenases de polissacarídeos líticas;Proteína heteróloga;Lytic polysaccharide monooxygenases;Heterologous protein
Issue Date: 26-Apr-2017
Publisher: Universidade Federal do Tocantins
Program: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - PPGB
Citation: SANTOS, Fernanda Pinheiro dos. Expressão e produção de monoxigenases bacterianas em komagataella phafii (pichia pastoris) para utilização como enzimas acessórias para desconstrução de biomassa.2017.67f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Universidade Federal do Tocantins, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Gurupi, 2017.
Resumo: A descoberta das monoxigenases de polissacarídeos líticas dependentes de cobre (LPMOs), que agem em sinergismo com outras enzimas na desconstrução da celulose, gerou um grande interesse da comunidade científica por seu potencial de aplicação na produção de biocombustíveis a partir de resíduos lignocelulósicos. A busca por essas proteínas auxiliares em microrganismos surgiu como uma estratégia promissora, pois há grande diversidade de isoformas e disponibilidade de sequências genômicas dessas proteínas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo expressar LPMOs recombinantes de origem bacteriana em levedura Komagataella phafii. Foram obtidos clones de K. phafii transformados com 6 genes selecionados a partir de banco de dados. Análises da cinética de expressão proteica por técnica de western blot indicaram secreção apenas da LPMO de 25 kDa codificada pelo gene de Thermobifida fusca YX. Ensaios de produção da LPMO de T. fusca foram realizados em biorreator de 1L e Erlenmeyers de 250 mL e 1000 mL. Nos ensaios em Erlenmeyers houve a detecção da proteína, confirmada por SDS-PAGE e western blot, acompanhado de um alto crescimento microbiano. No ensaio em biorreator não houve detecção da proteína de interesse e o crescimento microbiano foi baixo. Com a confirmação da expressão da LPMO nos ensaios em Erlenmeyers, estes foram parcialmente purificados e avaliados por gel de proteínas e western blot. Os resultados obtidos mostram que o sistema de expressão de K. phafii foi eficiente, expressando a LPMO de T. fusca.
Abstract: The discovery of copper-dependent lytic polysaccharide monooxygenase (LPMOs), auxiliary proteins which act in synergy with other enzymes on the cellulose degradation, generated a great interest from the scientific community due to their potential application in biofuels production from lignocellulosic residues. The search for these auxiliary proteins in microorganisms has emerged as a promising strategy because there is a great diversity of isoforms and availability of genomic sequences. Thus, the present work aimed to express bacterial LPMOs in Komagataella phafii. Clones of K. phafii transformed with 6 genes selected from database were obtained. Analysis of protein expression kinetics by western blot technique showed accumulation only of the LPMO of 25 kDa coded by the gene from Thermobifida fusca YX. Production of LPMO from T. fusca was tested in 1 L bioreactor and 250 mL and 1000 mL Erlenmeyer flasks. In Erlenmeyer flasks experiments, there was protein detection, confirmed by SDS-PAGE and western blot, and a high microbial growth. In the bioreactor assay, there was no target protein detection, and microbial growth was low. After confirmation of LPMO expression in Erlenmeyer flasks assays, protein were partially purified and confirmed by protein gel and western blot. Results obtained showed that the expression system of K. phafii was effective, expressing the LPMO from T. fusca.
URI: http://hdl.handle.net/11612/438
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