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Author: Sousa, Gleiciane Pinheiro de
Advisor: Aguiar, Raimundo Wagner de Souza
Title: Caracterização molecular e enzimática de fungos endofíticos de cana-de-açúcar e seu potencial para desconstrução de biomassa lignocelulósica
Keywords: Fungos endofíticos;Saccharum officinarum;Enzimas lignocelulolíticas;Bagaço de cana-de-açúcar;Endophytic fungi;Lignocellulolytic enzymes;Sugarcane bagasse
Issue Date: 31-Mar-2017
Publisher: Universidade Federal do Tocantins
Program: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - PPGB
Citation: SOUSA, Gleiciane Pinheiro de. Caracterização molecular e enzimática de fungos endofíticos de cana-de-açúcar e seu potencial para desconstrução de biomassa lignocelulósica.2017.124f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Universidade Federal do Tocantins, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Gurupi, 2017.
Resumo: A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil, principalmente devido à produção de etanol para uso como biocombustível. A conversão de biomassa lignocelulósica em etanol e químicos renováveis pode ser obtida por meio da utilização de microrganismos capazes de produzir enzimas lignocelulolíticas em concentrações elevadas e serem cultivados em substratos de baixo custo. Microrganismos endofíticos habitam o interior das plantas sem induzir sintomas de doença e sem produzir estruturas externas. O potencial biotecnológico de microrganismos endofíticos de cana-de-açúcar tem sido pouco explorado, especialmente quanto à capacidade de produção de enzimas para desconstrução de biomassa lignocelulósica. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular e enzimática de uma coleção de fungos isolados de cana-de-açúcar, bem como selecionar linhagens promissoras para a hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor. Para tanto, 409 linhagens foram caracterizadas quanto à capacidade de hidrolisar polissacarídeos (Avicel; carboximetilcelulose - CMC; xilana; pectina e amido) em meio de cultura sólido. A caracterização molecular foi realizada por meio de análise da sequência da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico. Linhagens promissoras foram selecionadas para avaliação do potencial de sacarificação (produção de celulases por meio de determinação de FPase - Filter Paper Activity) e hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar. O fungo Trichoderma reesei RUT C-30 (ATCC 56765) foi utilizado como controle positivo. De 409 linhagens, 63,57% hidrolisaram CMC, 79,21% xilana, 77,50% pectina e 41,07% amido. O crescimento em Avicel foi observado para 84,60% das linhagens. Os maiores valores de índice enzimático foram (3,150,12) em CMC; (5,301,06) em xilana; (5,000,00) em pectina e (2,830,23) em amido. Sequências de qualidade da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico foram obtidas para 296 das 409 linhagens avaliadas. A análise filogenética permitiu classificar as linhagens ao nível de espécie. Dos 409 fungos, 20 foram cultivados em meio líquido contendo bagaço de cana-de-açúcar (pré-tratado por explosão a vapor, seco e triturado) como fonte de carbono para determinação do potencial de sacarificação (FPase) e de proteína total. Treze extratos foram escolhidos para realização de experimentos de hidrólise enzimática. Os resultados mostraram que nas condições utilizadas (5% de sólidos, 50 mg de proteína/g de glicanas, 200 rpm, 50°C por 32 horas), a capacidade hidrolítica do extrato avaliada pela produção de açúcares redutores totais (ART) foi destacada para as linhagens Omnidenptus affinis (94), Talaromyces pinophilus (AR156) e Talaromyces assiutensis (AR264) (ART = 11,77 g/L, 11,53 g/L e 10,11 g/L, respectivamente), quando comparada com a linhagem controle T. reesei RUT C-30 (ART = 11,04 g/L). A quantidade de glicose liberada analisada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi de 9,33 g/L para a linhagem O. affinis (94), 8,94 g/L para T. pinophilus (AR156) e 7,69 g/L para T. assiutensis (AR264), quando comparada com o extrato de T. reesei RUT C-30 (2,29 g/L). Estes resultados revelam que fungos endofíticos de cana-de-açúcar constituem uma fonte promissora de novas linhagens produtoras de enzimas lignocelulolíticas para conversão de bagaço de cana-de-açúcar em açúcares fermentescíveis, no contexto de biorrefinarias.
Abstract: Sugarcane is one of the main crops in Brazil, mainly due to the production of ethanol for use as biofuel. The conversion of lignocellulosic biomass to ethanol and renewable chemicals can be achieved by using microorganisms capable of producing lignocellulolytic enzymes in high concentrations and grown on low cost substrates. Endophytic microorganisms inhabit the interior of plants without inducing symptoms of disease and without producing external structures. The biotechnological potential of sugarcane endophytic microorganisms has been little explored, especially regarding the production capacity of enzymes for the deconstruction of lignocellulosic biomass. In this context, the objective of this work was to perform the molecular and enzymatic characterization of a collection of fungi isolated from sugarcane, as well as to select promising strains for the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by explosion at steam. For this purpose, 409 strains were characterized for the ability to hydrolyze polysaccharides (Avicel; carboxymethylcellulose - CMC; xylan; pectin and starch) in solid culture medium. Molecular characterization was performed by means of sequence analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region of ribosomal DNA. Promising strains were selected for evaluation of saccharification potential (production of cellulases by means of determination of FPase - Filter Paper Activity) and enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse. The fungus Trichoderma reesei RUT C-30 (ATCC 56765) was used as a positive control. In 409 strains, 63,57% hydrolyzed CMC, 79,21% xylan, 77,50% pectin and 41,07% starch. Avicel growth was observed for 84,60% of the strains. The highest values of enzymatic index were (3,15 ± 0,12) in CMC; (5,30 ± 1,06) in xylan; (5,00±0,00) in pectin and (2,83±0,23) in starch. Quality sequences of the ITS1-5.8S-ITS2 region of ribosomal DNA were obtained for 296 of the 409 strains evaluated. The phylogenetic analysis allowed to classify the strains at the species level. Of the 409 fungi, 20 were cultivated in liquid medium containing sugarcane bagasse (pretreated by steam explosion, dry and crushed) as carbon source to determine the potential of saccharification (FPase) and total protein. Thirteen extracts were selected for enzymatic hydrolysis experiments. The results showed that under the conditions used (5% solids, 50 mg protein/g glycans, 200 rpm, 50 °C for 32 hours), the hydrolytic capacity of the extract evaluated by the production of total reducing sugars (ART) was highlighted for the strains Omnidenptus affinis (94), Talaromyces pinophilus (AR156) and Talaromyces assiutensis (AR264) (ART = 11,77 g/L, 11,53 g/L and 10,11 g/L, respectively), when compared to the control strain T. reesei RUT C-30 (ART = 11,04 g/L). The amount of released glucose analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was 9,33 g/L for the strain O. affinis (94), 8,94 g/L for T. pinophilus (AR156) and 7,69 g/L for T. assiutensis (AR264) when compared to T. reesei extract RUT C-30 2.29 g/L. These results reveal that endophytic fungi of sugarcane constitute a promising source of new lignocellulolytic enzyme producing strains for the conversion of sugarcane bagasse to fermentable sugars in the context of biorefineries.
URI: http://hdl.handle.net/11612/433
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